导读
从年起，我国啤酒产销量均为世界第一，并保持连续增长。与此同时，啤酒企业每年要投入大量费用用于处理生产废水。由于啤酒生产废水含有较高浓度的有机物、N、P、无机盐等营养物质，直接处理会造成资源的浪费。目前，研究者对资源化利用啤酒生产废水进行了有益的探索，但啤酒生产废水的综合利用仍是尚未解决的实际难题，是当今环保领域亟待研究的课题之一。为探讨啤酒废水资源化利用的有效途径，笔者在前期研究基础上，对7种酵母菌利用啤酒废水发酵进行了筛选，考察了酵母菌株对啤酒废水COD降解率、产微生物油脂和产菌体蛋白能力的影响，以期为实现啤酒生产废水的资源化利用探索新的途径和方法。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验菌株(见表1)
1.1.2培养基
(1)活化培养基为YEPD固体培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏或酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，自然pH。于℃饱和蒸汽灭菌20min。
(2)种子培养基为YEPD液体培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏或酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，自然pH。于℃饱和蒸汽灭菌20min。
(3)发酵培养基：自然沉降24h的啤酒生产废水(南阳天冠啤酒厂)，以1：1稀释后调节其pH为5.8～6.0。于℃饱和蒸汽灭菌20min。
1.1.3实验试剂
酵母粉(BR)、蛋白胨(BR)、葡萄糖(AR)、琼脂(BR)、硫酸铜(AR)、硫酸钾(AR)、硼酸(AR)、氢氧化钠(AR)、苯酚(AR)、浓盐酸(AR)、浓硫酸(AR)、3，5-二硝基水杨酸(AR)、无水乙醇(AR)、硫酸亚铁铵(AR)、硫酸汞(AR)、七水硫酸镁(AR)、甲醇(AR)、三氯甲烷(AR)、重铬酸钾(AR)、邻苯二甲酸氢钾(AR)等。
1.1.4实验仪器
SW—CJ一2G超净工作台；HZQ—B大型全温摇床；N紫外一可见分光光度计；TDL一40B低速离心机；TDL一40B高速离心机；DNP一电热恒温培养箱；—2A电热鼓风干燥箱；LDZX一50FB立式压力蒸汽灭菌锅；PHS一3C精密pH计；一20℃冰箱；日立L一全自动氨基酸分析仪；天美TMGC气相色谱仪附氢火焰离子化检测器(FID)；浙江大学T色谱工作站。
1.2实验方法
1.2.1培养方法
接1环保藏菌株至YEPD固体斜面培养基，28℃恒温箱中培养3～4d。接适量活化后的菌体于YEPD液体种子培养基中(mL锥形瓶中装液量为50mL)，28℃、r/min培养36～48h。然后把种子培养液按10％的接种量接种于发酵培养基中(mL锥形瓶中装液量为mL)，28℃、r/min摇床培养h。
1.2.2测定方法
(1)菌体生物量的测定：采用干重法测定菌体生物量。
(2)油脂的测定：采用酸热法提取微生物油脂。
油脂产量=提取油脂的质量/发酵液体积
油脂含量=提取油脂的质量/发酵液生物量×％
油脂系数=消耗g糖转化为油脂的质量
(3)总糖的测定：采用苯酚-硫酸法测定总糖。以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，Y=0.00+0.X，R2=0.。
(4)还原糖的测定：采用3、5-二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖。以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，Y=-0.+0.X，R2=0.。
(5)总氮的测定：采用凯氏定氮法测定总氮。
菌体粗蛋白产量=粗蛋白质量/发酵液体积
干菌粗蛋白含量=粗蛋白质量/干菌体质量×％
蛋白系数=消耗g糖转化为蛋白质的质量
(6)COD的测定：采用重铬酸钾法测定COD。
(7)pH的测定：采用PHS一3C精密pH计测定pH。
(8)菌体蛋白氨基酸组成的测定：采用GB/T—茚三酮分光光度法测定氨基酸组成。
(9)菌体油脂脂肪酸组成分析：待测样品甲酯化。色谱柱为TM石英毛细管柱(25m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：℃保持1min，以15℃/min升至℃后保持5min；汽化温度℃；进样量0.3μm；检测器(FID)温度℃；燃气(H2)流速20mL/min；载气N2)流速90mL/min；助燃气(空气)流速60mL/min；分流比1：10。脂肪酸通过对照标准品定性，用面积归一化法确定相对含量。
(10)不饱和脂肪酸指数(IUFA)计算：参照文献。
（李加兴，李倔，吴越，等．*秋葵籽油的提取工艺优化及脂肪酸组成分析[J]．中国油脂，，38(10)：5-8.）
2结果与分析
2.1不同酵母茵利用啤酒废水的产油脂能力
以啤酒生产废水为培养基，分别将7个菌株用1.2.1的方法进行培养，测定其生物量、油脂产量、油脂含量和油脂系数，结果见表2。
由表2可以看出，在接种量、培养时间、培养温度、摇床转速等相同的条件下，不同菌株的产油脂能力不同。6#菌株的油脂产量、油脂含量最高，其次是1#菌株，其油脂含量达31.99％；2#、5#和7#菌株的油脂含量均在20％以上；而3#和4#菌株的油脂含量较低，分别只有15.38％和17.07％。以菌体生物量、油脂产量、油脂含量和油脂系数指标综合来考虑，可以确定6#和1#菌株在啤酒废水中产油能力最好。
2.2不同酵母茵利用啤酒废水产茵体蛋白能力
以啤酒生产废水为培养基，分别将7个产油脂酵母菌株按1.2.1的方法培养，测定其生物量、菌体粗蛋白产量、干菌粗蛋白含量和蛋白系数，结果见表3。
由表3可见，在相同的培养条件下，不同菌株的产菌体蛋白能力有显著的差异，不同酵母菌株的干菌粗蛋白含量也不相同。1#和6#菌株的干菌粗蛋白含量最高，分别达到30．64％和29.15％；其次3#、5#和7#菌株的干菌粗蛋白含量为20％以上，2#和4#菌株的干菌粗蛋白含量最低，只有16％左右。以菌体生物量、菌体粗蛋白产量、干菌粗蛋白含量和蛋白系数为指标进行综合考虑，1#、5#和6#菌株利用啤酒生产废水产菌体蛋白能力较好。
2.3不同酵母茵处理啤酒废水的COD降解率
以啤酒生产废水为培养基，分别将7个菌株用1.2.1的方法进行培养，测定其COD降解率，结果见图1。由图1可以看出，在相同的培养条件下，不同菌株对废水的COD降解率不同。6#和7#菌株对废水的COD降解率最高，分别达到89.09％和89.67％；其次1#和2#菌株分别为81.47％和79.83％；3#、4#和5#菌株对废水的COD降解率较低，均在60％以下。
综上所述，通过对7个不同酵母菌株利用啤酒生产废水产油脂能力、产菌体蛋白能力和对废水COD降解率的考察，6#和1#菌株的各项指标较好，可以确定为啤酒产生废水资源化利用的优良酵母菌株。6#和1#产油脂酵母菌株在啤酒生产废水中发酵后菌体和脂肪球形态，见图2。
2.46#和1#菌株发酵周期分析
利用不添加任何营养成分的啤酒生产废水为培养基，分别将筛选出的6样菌株和1撑菌株用1.2.1的方法进行培养，每24h取样，测定各项发酵指标，结果分别见表4和表5。
由表4和表5可以看出，6#菌株和1#菌株的发酵过程可分为菌体生长期和油脂积累期。6#菌株和1#菌株在培养的前72h，菌体生长旺盛，菌体生物量有较大增幅，COD降解率也有较大提高，而油脂积累较少；6#菌株在培养96h时，菌体的油脂系数和油脂含量达到最大，分别为14.79和44.98％，随着培养时间的延长，在h菌体油脂产量达到最大值、生物量和COD降解率接近最高值，分别为8.93、20.94g/L和89.09％，而油脂含量和油脂系数却略有降低。1#菌株在发酵h时，菌体生物量、油脂产量、油脂含量、油脂系数和COD降解率均基本达到最高值，分别为14.44g/L、4.62g/L、31.99％、13.76和81.47％。在培养h后，由于营养物质的大量消耗，6#菌株和1#菌株的发酵进入衰亡期，菌体油脂产量、油脂含量和油脂系数均有所降低，但COD降解率却没有明显变化。因此，经过综合分析，可以确定6#和1#菌株的适宜发酵周期为h。
2.56#和1#菌株产油脂的脂肪酸组成和茵体蛋白的氨基酸组成分析
以啤酒生产废水为培养基，在10％的接种量、mL的装液量、28℃、r/min的条件下对6#和1#菌株培养h，发酵结束后收集菌体并进行干燥，提取微生物油脂，利用气相色谱对其脂肪酸组成进行分析，结果见表6。并依据GB/T—的检测方法，利用氨基酸自动分析仪测定菌体蛋白的氨基酸含量，结果见表7。
由表6可以看出，6#和1#菌株产油脂的脂肪酸组成均以C16和C18系列为主，脂肪酸相对含量最高的是油酸(C18:1)和棕榈酸(C16:0)，分别为61.57％、22.20％和58.86％、34.38％，不饱和脂肪酸指数分别达到80.33％和61.57％，均与植物油的脂肪酸组成相似，可作为生物柴油新油源。
由表7可以看出，6#和1#菌株菌体蛋白在18种氨基酸中只有脯氨酸未被检出，其中8种必需氨基酸占氨基酸总量的比例分别达到44.14％和4.23％，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值分别为0.和0.。由此可以看出，6#和1#菌株菌体蛋白中必需氨基酸含量高于常见的蛋白饲料，且还普遍高于常见的肉类食物，完全达到了FAO/WHO40％的要求，完全可以充当动物的蛋白饲料。
3结论
(1)从7个酵母菌株筛选出资源化利用啤酒生产废水程度较高的2个优良菌株6#——TrichosporonporosumD02和1#——斯达油脂酵母LipomyCesstarkeyi，培养h时，2个优良菌株的生物量、油脂产量、油脂含量、菌体粗蛋白产量、干菌粗蛋白含量和COD降解率依次分别为20.94g/L、8.93g/L、42.65％、6.1g/L、29.15％、89.09％和14.44L、4.62g/L、31.99％、4.42g/L、30.64％、81.47％，2个酵母菌株利用啤酒工业废水的综合发酵效果较好。
(2)2个优良菌株6#——TrichosporonporosumD02和1#——斯达油脂酵母Lipomycesstarkeyi利用啤酒生产废水产菌体油脂的脂肪酸组成均以C18和C16系列为主，脂肪酸相对含量最高的是油酸(C18：1)和棕榈酸(C16：0)，分别为61.57％、22.20％和58．86％、34.48％，不饱和脂肪酸指数分别达到80.33％和61.57％，与植物油的脂肪酸组成相似，可作为生物柴油新油源。
(3)2个优良菌株6#——Trichosporonporosum02和1#——斯达油脂酵母Lipomycesstarkeyi利用啤酒生产废水产菌体粗蛋白的氨基酸组成除脯氨酸未被检出，其余17种氨基酸均被检出。其中8种必需氨基酸占氨基酸总量的比例分别达到44.14％和44.23％，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值分别为0.和0.。6#和1#菌株菌体蛋白中必需氨基酸含量与常见的蛋白饲料相比要高，并且普遍高于常见的肉类食物，达到了FAO/WHO40％的要求，完全可以充当动物饲料，其营养成分甚至达到了食品的要求。
(4)啤酒生产废水中的营养物质可利用性较高，采用优良产油脂酵母菌对废水进行处理，不仅可以极大降低啤酒废水中的COD，同时还可以获得高附加值的微生物油脂和菌体蛋白等产品，这为探索实现废水的综合资源化利用提供了新的途径和依据。
注：本文由生物饲料开发国家工程研究中心（BFC）小编整理发布，如有任何建议或意见及投稿等，请您加小编
