磷脂酶A1（PlaA1）在食品、医疗、纺织等行业用途十分广泛，其主要用途为植物的油脂脱胶。PlaA1将植物粗油中存在的磷脂杂质进行酶解，生成游离脂肪酸和亲水性溶血磷脂，以提高后期油脂存储的稳定性。目前，关于PlaA1的研究，主要集中于对其本身进行分子改造和发酵工艺条件优化以提高PlaA1的催化活性。对PlaS进行生物信息学分析发现，PlaS属于锚蛋白（Ankyrin，ANK）家族中的ANK2家族，根据GenBank（Protein-ID：AFN.1）数据分析，其蛋白结构是由N端、ANK区域和C端三部分区域组成，其中ANK区域包含4个典型的ANK重复序列（ANKreapeat）。ANK是一种胞内连接蛋白，为单链多肽，通常由若干个ANKrepeat串联而成，每一个ANKrepeat包含30～33个氨基酸，组成β2α2的“L”型结构，可以介导蛋白质与蛋白质之间的相互作用。
为进一步探究PlaS对PlaA1酶活的关键作用区域，安徽工程大学生物与化学工程学院的杨蒙、薛正莲*和甘玉飞等人从PlaA1和PlaS共表达基因plaB的C端处开始剪接，并对截短菌株进行了胞外酶学性质研究，为后期阐明PlaS对PlaA1胞外酶活的调节机制提供理论基础。1截短突变体的设计
根据NCBI网站对PlaS进行BLAST在线比对的结果显示，PlaS属于ANK超家族，且含有4个典型的ANKrepeat，分别在PlaS氨基酸序列的46～76、78～、～、～位置处。PlaS二级结构主要由α-螺旋、β-折叠以及无规卷曲组成，其中α-螺旋占比高达54.86%，无规卷曲占比达到34.24%。每一个ANKrepeat都包含着2个α-螺旋和2个β-折叠，内部形成高度疏水区域。为探讨PlaS对PlaA1酶活的关键调控区域，将其编码基因进行截短，图1为截短基因线性示意图。
2重组子的构建
以pET-28a-plaB质粒为模板，利用PCR技术对截短基因片段进行大量扩增，并将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。从琼脂糖凝胶电泳条带（图2）表明，与截短目的基因相符。从PLB平板上分别挑取阳性克隆子，接种到含有δ50卡那霉素的5mLLB试管中，37℃、r/min摇床过夜培养，按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行制备质粒DNA样品。将阳性菌株送去南京金丝瑞公司进行测序，通过软件DNAMAN进行序列比对，序列一致。将其分别进行保存，用于后续实验。
3各截短菌株胞外酶活的分析
为研究plaS的截短基因对PlaA1胞外酶活的影响，对各突变菌株所产透明圈进行圈径比的计算。由于未截短菌株BP28与各截短突变菌株均含有plaA1基因，PlaA1可水解PLB平板上的大豆卵磷脂，在溴甲酚紫的作用下，可产生透明圈如图3所示。
结合图4各菌比酶活数据来看，当PlaS的C端区域缺失，ANK结构域保存3～4个ANKrepeat序列时，截短菌株AN-3与AN-4所产的PlaA1胞外比酶活分别为.46U/mg和.16U/mg，表现为胞外促进，达显著水平（P＜0.05），与未截短菌株BP28PlaA1胞外比酶活（60.88U/mg）相比分别高了73%和78%。当ANKrepeat的个数继续减少时，PlaA1胞外比酶活开始显著降低，截短菌株AN-1、AN-2PlaA1胞外比酶活分别为59.31、60.74U/mg，当PlaS的ANK结构域完全缺失时，截短菌株ANPlaA1胞外比酶活为57.19U/mg，与截短菌株AN-1、AN-2PlaA1的胞外比酶活并无显著差异。同时各菌株的胞内比酶活表现出无显著差异。从胞外比酶活的数据来看，在PlaS中ANK结构域至少需要3个ANKreapeat串联才会对PlaA1酶活表现为胞外促进作用。
4各截短菌株的酶学性质分析
4.1温度对各截短菌株PlaA1酶活的影响在最适温度45℃条件下，以未截短菌株BP28的PlaA1酶活定义为%计算相对酶活力，截短菌株AN、AN-1、AN-2、AN-3、AN-4的PlaA1相对酶活力分别为85.29%、84.80%、87.25%、.29%、.06%（图5a）。结合图5b可知，在45℃条件下，虽然突变菌AN-3、AN-4所产PlaA1的相对酶活力表现最高，但是其热稳定性也表现最差，推测PlaS的C端部分可维持PlaA1的结构稳定性。当PlaS的ANKrepeat被继续截短时，AN、AN-1、AN-2所产PlaA1的相对酶活力有所下降，可能因为plaS的过度剪截在一定程度上破坏了辅助蛋白的结构。
4.2pH值对各截短菌株PlaA1酶活的影响
如图6a所示，截短菌株AN-3、AN-4所产生的PlaA1的最适pH值与BP28的相同，最适pH值均为6。而截短菌株AN、AN-1、AN-2的最适pH值发生了酸性偏移，最适pH值为5，说明辅助蛋白对PlaA1的酸碱性进行了一定程度的调控。由图6b可知，当反应体系的pH3～5时，各突变株的PlaA1活性呈现上升趋势。各突变株在pH值在5～8的条件下均表现为较好的稳定性。
4.3各截短菌株PlaA1酶促动力学参数的测定
双倒数法确定各截短菌株PlaA1的米氏常数及酶动力学见图7。根据所得到的各截短菌株的动力学参数来看，截短菌株AN-3与AN-4所产PlaA1的Km值与BP28的相比分别降低了1.37倍和1.45倍，催化效率（Kcat/Km）分别提高了%和%，表明PlaS的C端及ANK结构域一个ANKrepeat被剪截后导致PlaA1空间构象发生改变，使得PlaA1与底物的亲和力增强，表现出更高的催化效率和酶活力。同时可看出在所有的截短菌株中AN菌株酶的Kcat/Km最小，其催化效率最低，进一步表明ANKrepeat的个数决定着ANK结构域的功能，对于调节PlaA1的胞外酶活起着重要作用。
讨论与结论
通过生物信息学分析发现，PlaS属于ANK2家族。在TMHMM网站中预测PlaA1和PlaS的跨膜结构图中得到PlaA1是无跨膜螺旋结构的，而PlaS在其N端区7～27aa有一个跨膜螺旋。PlaA1的胞外分泌可能是由于PlaS具有胞外运输的功能。遗憾的是，PlaS与PlaA1获得共表达时虽酶活较高，但是胞外蛋白表达量相对较低，在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）图上几乎看不到PlaS条带。
目前人们对ANK在原核生物中的生理作用知之甚少，一些细菌的ANK蛋白在微生物的作用机制尚不明确。本实验利用PCR技术对PlaS与PlaA1共表达基因plaB进行剪接，构建出一系列截短突变菌株，并分别测出各截短菌株胞外粗酶液的酶学性质，其中截短菌株AN-3与AN-4所产PlaA1酶活表现为胞外促进作用。实验结果表明PlaS中的ANK结构域至少需要3个ANKreapeat才会对PlaA1酶活表现为胞外促进作用，同时PlaS的C端域对于维持PlaA1的结构稳定性起到重要的作用。同时也说明了ANKreapeat的数目对于维持ANK结构域的功能发挥着关键性作用，为后期深入研究PlaS对促进PlaA1胞外分泌机理奠定了理论基础。
本文《辅助蛋白基因的剪接对磷脂酶A1酶活的影响》来源于《食品科学》年42卷6期-页，作者：杨蒙，薛正莲，甘玉飞，周杰，王洲，刘艳。DOI:10./spkx2--20115-。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
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